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BrdU, CFSE和GFP標記大鼠間充質干細胞的比較 [復制鏈接]

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發表于 2009-3-3 12:38 |只看該作者 |倒序瀏覽 |打印
作者:付霞霏,何援利,楊芳,彭冬先,劉木彪作者單位:南方醫科大學珠江醫院婦產科,廣東 廣州 510280
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  g. j5 }1 L' [7 `8 A* u* e5 i6 U                    * K3 h7 R1 a- t; y3 ?1 F
            
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3 a" o7 n) m4 e) J- \          【摘要】  目的: 研究BrdU, CFSE和GFP作為大鼠間充質干細胞標記物的可行性. 方法:  分別用上述三種標記物標記大鼠間充質干細胞,檢測即時、15和30 d的標記率,通過檢測細胞周期、凋亡率和描繪生長曲線,來明確標記物對體外培養大鼠間充質干細胞生長特性的影響;通過流式細胞儀檢測標記物對細胞表面標志(CD29, CD34, CD44, CD45)表達的影響. 結果: BrdU, CFSE, GFP的即時標記率為77.0%, 99.4%, 89.7%,1 mo后分別下降至51.9%, 77.5%, 82.9%. 三者對體外培養的大鼠間充質干細胞的生長特性和表面標志的表達均無明顯影響. 結論: GFP, BrdU和CFSE均可以作為大鼠間充質干細胞的標記物. 9 }4 e% B8 h6 N& ^; |6 A
          【關鍵詞】綠色熒光蛋白;溴脫氧尿嘧啶核苷;熒光染料CFSE;間充質干細胞5 }! x: ?0 T& D! F- m5 ]
                  基金項目:廣東省科技計劃項目(2006B35901003)
' ]! Y3 o" @7 ?. @7 i) ~+ ^) ~: t9 {( M, _( ^, A8 K% ^
  Comparative investigation of BrdU, CFSE and GFP as markers of rat MSCs% D( v$ Q5 [# Q9 a' h

' P# [+ y: b6 e; o4 c' M  FU XiaFei, HE YuanLi, YANG Fang, PENG DongXian, LIU MuBiao
) a5 K' ^& v0 I! T; c, A, @0 l0 ^+ k! \4 _! i# V
  Department of Obstetrics and Gynecology, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510280, China
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  【Abstract】 AIM: Toinvestigate the feasibility of labeling of BrdU, CFSE and GFP as labels of rat mesenchymal stem cells (MSCs) and to investigate the influence of the 3 markers on the growth characteristics and expressions of surface markers of rat MSCs. METHODS: Wistar rats bone marrow derived MSCs were isolated and purified in vitro by Percoll density gradient centrifugation combined with adherent method and were labeled with BrdU, CFSE and GFP, respectively. The immediate, 15day and 30day labeling efficiency of the 3 markers was quantified. The labeling efficiency of BrdU was detected with immunocytochemical method, and that of CFSE and GFP was detected via flow cytometry (FCM). The labeled MSCs were observed under microscope. Cell cycle and apoptosis rate of labeled MSCs were revealed and the growth curves were delineated, so as to identify whether or not the markers casted an influence on the cell growth characteristics in vitro. Furthermore, the surface markers (CD29, CD34, CD44, CD45)of the labeled MSCs were detected through flow cytometry and were compared with those of nonlabeled MSCs. RESULTS: The immediate labeling efficiency of BrdU, CFSE, and GFP was 77.0%, 99.4%,89.7% respectively, and the efficiency decreased to 51.9%, 77.5%, and 82.9% respectively after 30 d. There was no statistical difference in cell cycle and apoptosis ratio between labeled MSCs and nonlabeled MSCs. The growth curves of labeled MSCs were similar to that of nonlabeled MSCs. The 3 markers didnt influence the expressions of surface markers (CD29, CD34, CD44, CD45) of rat MSCs. CONCLUSION: The 3 markers have no effects on the growth characteristics and expressions of surface markers of rat MSCs cultured in vitro. BrdU, CFSE and GFP can serve as labeling markers of rat MSCs. BrdU and CFSE labeling can be used for short time tracing, and GFP labeling for long time tracing./ g$ h6 D, b: P! D6 Z! x- M
( Q& ^1 J. n) Q! W, X. O) N0 d2 `
  【Keywords】 GFP; BrdU; CFSE; MSCs
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  0引言
' O5 k+ j7 z2 N4 k1 j
  g# n5 S+ L* i& J' i/ h8 ]) J, Q  骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是定居于骨髓微環境中的一種成體干細胞. MSCs不僅能分泌多種細胞因子調節造血細胞的增生與分化,還具有自我增殖、多向分化的潛能[1]. 因其采集方法簡單、能在體外大量擴增、可自體移植避免免疫排斥和倫理問題,已成為組織修復的理想種子細胞和基因治療的靶細胞[2]. 而尋找合適的標記方法用于追蹤觀察MSCs在實驗研究中是很重要的. 目前常用的標記方法包括:溴脫氧尿嘧啶(5bromodeoxyuridine, BrdU)、熒光染料(如二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯,5,6carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標記. 我們從標記率、MSCs的生物學特性和表面標志的表達等方面對這三種標記方法進行較全面的比較.
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. r2 j2 L+ U# H* p2 R  A! D  1材料和方法: t" g: R! \8 d' A# w" G( D! x! U
( @  g! }$ L, I" Y6 x8 I
  1.1材料近交系SPF級6~8周齡Wistar大鼠20只,雌雄不拘,體質量120~150 g,由廣東省動物中心提供. DMEMF12培養基(Gibco公司),胎牛血清(Hyclone公司),CFSE(Sigma公司),BrdU(Sigma公司),小鼠抗BrdU抗體(Chemicon公司),山羊抗小鼠FITC(Santa Crutz公司),AdGFP(珠江醫院婦產科構建),CCK8試劑盒(Dojindo公司),磷酸鹽緩沖液(PBS,武漢博士德公司). CO2培養箱(Shell公司),熒光顯微鏡(Leica公司),流式細胞儀(Becton Dickinson公司).
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7 N6 L; O& R4 {* [  1.2方法
( ^% _! Y0 J8 c
/ E4 L; O5 M3 W. Z8 I; A  1.2.1大鼠MSCs的分離、培養及擴增用100 g/L水合氯醛麻醉大鼠后,無菌條件下取出脛骨和股骨,制備單細胞懸液,小心加入預先有密度為1.083的Percoll分離液的離心管內,兩種液體體積比為1∶1. 離心后,小心吸取中間界面乳白色的單個核細胞層,用PBS洗2次后加完全培養基(含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養基)重懸,接種培養. 待細胞鋪滿瓶底的80%~90%時,按1∶2傳代. 本實驗中選用生長良好的第3代大鼠MSCs.
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1 ^/ I; O8 L% \, f* ]  1.2.2BrdU標記方法及標記率的檢測待細胞長至約50%融合時,吸棄培養基,加入BrdU濃度為10 μmol/L的培養基,置培養箱中孵育48 h. 棄去培養基,PBS清洗,以40 g/L多聚甲醛固定30 min. 再用PBS清洗3次后,加入10 g/L牛血清白蛋白,甩凈余液后,加入小鼠的抗BrdU抗體,于濕盒中37℃孵育4 h,PBS清洗3次后,避光加入山羊抗小鼠FITC熒光抗體,避光孵育1 h,PBS清洗3次后,熒光顯微鏡下觀察細胞的即時標記情況. 隨機選取5個視野,平均標記率,即為BrdU的即時標記率. 同批BrdU標記的大鼠MSCs繼續培養、傳代,分別于15,30 d后再檢測標記率.
5 K+ f( D$ F8 q3 Y9 a5 o
/ r. F/ k5 ~1 \1 P) j$ \; o  1.2.3CFSE標記方法和標記率檢測待大鼠MSCs長至約鋪滿瓶底的80%時,加入CFSE,并使其終濃度為5 μmol/L,置培養箱中繼續孵育40 min. PBS洗3次后,流式細胞儀檢測熒光標記率,以未標記的MSCs作為對照. 同批CFSE標記的大鼠MSCs繼續培養、傳代,分別于15,30 d后再檢測標記率./ s* g1 C6 s& ~7 ^" M% E7 e- H
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  1.2.4AdGFP標記方法和標記率的檢測取病毒儲存液在HEK293細胞中反復擴增,收集培養上清及細胞,反復凍溶破壞細胞離心取上清、過濾除菌,氯化銫密度梯度離心法進行純化,空斑實驗法測定轉染液病毒滴度為21013 pfu/L. 待大鼠MSCs長至約鋪滿瓶底的80%時,加入感染復數(multiplicity of infection,MOI)為100的AdGFP,并于12,24,48和72 h,于熒光顯微鏡下觀察標記情況. GFP標記72 h后,以未標記的MSCs做對照,用流式細胞儀進行熒光標記率檢測. 同批GFP標記的大鼠MSCs繼續培養、傳代,分別于15,30 d后再檢測標記率.! W+ D9 J0 k3 K
. I* L; o4 V; f
  1.2.5細胞周期和凋亡率的檢測標記后24 h, MSCs經胰酶消化后,以PBS重懸為細胞密度為1109/L的單細胞懸液,用流式細胞儀檢測不同方法標記的MSCs的細胞周期和凋亡率.
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& U+ z" x+ k- K# @! ?  1.2.6表面標志檢測三種方法標記及未標記的大鼠MSCs分別用胰酶消化、PBS洗滌后制成109/L的單細胞懸液,流式細胞儀檢測細胞表面CD29,CD34,CD44,CD45的表達., d6 k' a; D7 w1 P$ w+ b

5 _& e% O6 M! i$ d  1.2.7細胞增殖能力檢測應用CCK8試劑盒檢測分別用三種方法標記及未標記大鼠MSCs的增殖能力,并繪制生長曲線. 于96孔板的每個孔中加入100 μL細胞懸液,細胞數為1103個. 于細胞接種后的7 d內,每天取5個孔進行檢測,每個孔內加入CCK8試劑10 μL,置培養箱內孵育4 h后,用全自動酶標儀檢測A450 nm值. 取其均值,以培養時間為橫坐標,以相應的A450 nm為縱坐標,描繪生長曲線.
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  統計學處理:數據以x±s表示,用SPSS12.0統計軟件處理,采用單向方差分析(Oneway ANOVA),組間比較采用多重比較SNK法.0 C/ Z- p. f; l2 R/ W
. n" R" k$ p6 n" `% P2 e" y
  2結果* c# z4 [# o, B/ b2 K4 P2 F

- x" j7 X6 F" t/ `  2.1大鼠MSCs培養接種后24 h,細胞為圓形,部分細胞貼附于瓶底,折光性較強. 72 h后絕大部分細胞貼壁,梭形,呈集落樣生長,折光性差. 培養7~10 d后,集落增多融合成片,鋪滿瓶底的80%,可進行細胞的首次傳代. 傳3~4代后,細胞為長梭形,形態均一,排列有序(圖1).
! g! N# X5 U0 c
: S# m/ h8 Y# W- e  2.2三種方法的標記率三種方法的即時標記率、15 d標記率和30 d標記率見表1. AdGFP感染大鼠MSCs后24 h即可見到有綠色熒光蛋白的表達,以后逐漸增強,72 h可見到較強的綠色熒光,之后表達趨于穩定(圖2). 病毒感染復數(MOI)大于100時,細胞病理現象明顯,細胞的正常增殖受影響(本實驗中的標記率及其余指標均在MOI為100的條件下測定).表1三種方法的標記率(略)
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  2.3細胞周期和凋亡率未標記及標記的大鼠MSCs,大部分細胞處于靜止期及DNA合成前期(G0/G1期),只有少數處于有絲分裂期和DNA合成期(S期和G2M期),4組細胞各期的細胞比例無明顯統計學差異(P>0.05). 未標記組,BrdU,CFSE,GFP標記組的凋亡率分別為:(3.6±0.9)%,(3.7±0.5)%,(3.3±0.8)%,(3.3±0.6)%,統計學上無顯著性差異(P>0.05).3 z+ I' X( h/ S1 N/ e! b

* ~; R: h* J4 r2 ~3 v" E; B  2.4表面標志培養的第3代細胞95%以上CD34和CD45陰性,CD44和CD29陽性,證實為間充質干細胞. 3種標記方法均不會影響大鼠MSCs表面抗原的表達(圖3).2 {7 J  u8 H5 U

9 |! [/ Q4 M. c  2.5增殖能力4組細胞均于第3日至第5日處于快速生長期. 對各個時間點的A值進行單向方差分析,結果表明各組之間無統計學差異(P>0.05).$ k. t6 s0 @3 L

4 w  A! }2 n, G4 D3 S* h  3討論: r! s. h5 q2 Y1 j2 A% g

% y8 k/ m& r, m) p& f3 a4 H  由于MSCs具有多向分化的潛能和能進行自體移植的優勢,在組織工程和基因治療中具有廣闊的應用前景[3]. 而進行細胞標記、對細胞進行示蹤是研究中必不可少的環節. BrdU的標記方法簡單易行,標記率較高、安全無毒性. 本結果表明BrdU的即時標記率達76.95%,且不會影響細胞的形態、生長、增殖能力和表面標志的表達. 但是,近年來的研究結果表明,隨著細胞的分裂BrdU標記強度會降低或標記丟失,本實驗也證實了這一點,因此,BrdU標記適用短期標記MSCs. 此外,已經移植的BrdU標記細胞,在其死亡后,能將BrdU釋放出來,并被鄰近的受體細胞攝取,從而出現假陽性標記[4].
7 u+ k" o' P# i
. _' z% ^* H# F, D, @6 f# o  二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)是一種可穿過細胞膜的熒光染料,進入細胞后不可逆地與細胞內的氨基結合偶聯到細胞蛋白質上,且不會引起細胞發生凋亡或死亡[5]. 本實驗我們所用的三種標記方法中,CFSE標記方法最簡便、標記率最高,幾乎達到100%,而且標記細胞形態良好,增殖能力和表面標志的表達不受影響. 細胞經CFSE染色后,在分裂增殖的過程中,標記的CFSE 可平均分配到子代細胞中,使熒光在細胞分裂增殖過程中被逐漸稀釋,因而熒光強度逐漸減弱[6]. 本結果表明隨著細胞的增殖,標記細胞的熒光強度逐漸減弱,標記率也隨之降低,因此,CFSE標記也適用于短時期示蹤.
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  綠色熒光蛋白(GFP)是從水母中分離獲得的一種發光蛋白,其常用標記細胞方式有3種:質粒載體轉染、病毒載體轉染和綠色熒光蛋白轉基因動物. 本實驗我們選擇的pAdEasy腺病毒表達載體系統,產生的病毒滴度高,轉染效率高,表達穩定,其DNA不整合到宿主基因組[7]. AdGFP感染大鼠MSCs 72 h的感染效率將近90%,細胞形態、增殖能力和表面標志不受影響,且可在體外長期穩定表達. 腺病毒對MSCs的感染率不能達到100%,原因可能為MSCs是由處于不同分化程度,且分化程度在不斷變化的多個亞群的細胞組成的緣故[8]. 相對于其他兩種標記方法,GFP的標記率不及CFSE、病毒載體構建過程比較繁瑣,但具有長期穩定的優點,適用于較長時間的示蹤.9 K; F" Z0 `% q. E, S) K& U
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  BrdU, CFSE和GFP都可用于標記大鼠MSCs,在體外對MSCs的生長特性和表面標志的表達無明顯不良影響. BrdU和CFSE標記方法簡便,但標記率隨著細胞的分裂增殖不斷降低. GFP由于標記高效穩定的優點,具有良好的應用前景.
% O% u5 y. g* U( y0 i          【參考文獻】
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誰都不容易啊 ~~  

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初來乍到,請多多關照。。。  

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不是吧  
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